植物種子和組織的保存技術

保存種子、孢子和組織等在人工條件下使植物的種類及它們的遺傳基因能得到延續，爲未來 的植物利用、培育計劃服務，這是植物遷地保護的另一種方法。這種方法的好處是所佔的空 間小，所需的人力資源少，但資金除了一次性的投入大外，今後在維持上需要的投入也大； 雖然它能較好地保護遺傳基因的多樣性，但這種方法只能維持它們從自然採集時所停留的進化階段。

一、種子的貯存

很多國家從50年代以來十分重視資源的收集和保存，已建立了國家種子保護試驗站(Nationa l seed storage laboratory)，並組成了國際植物遺傳局(International Board for Plant Genetic Resources)的世界性網絡。

種子保存包括了野生和栽培植物的遺傳基因兩大部分。保存種子(對於蕨類植物來說是則是 孢子)，除了要應用上述多基因庫採集法收集外，還需要一定的數量。在美國，有的規定， 在收集原始樣品時，每一種起碼要有一萬顆種子，當然它的數量是可能困種子稀少或顆粒大 小不同而有所變化。種子保存需要爲不同的種子創造不同的條件，以保證種子有高存活率。

1. 種子庫的條件和種子保存的程序

根據有關資料資料，從60年代開始至1986年，全世界共建了大中型基因庫225個，分佈在99 個國家中，貯存了約25000 000份種質材料(Fitzgerald ,1989)僅美國國家植物種質庫(Nati onal Plant Germplasm System-NPGS)就保存了8700 種植物的400 000份種子，在科羅拉多 的Fort Collins的種子庫則在-196℃保存了260 000份含水量6%的植物種子(Abelson, 1991 年)。我國也已有一些科研單位建立了一批大、中、小型種質基因庫，如中國農科院在1984年和1986年分兩期在北京建立了一座較大型的國家農作物種質庫，包括一座長期庫和一座交換，而於90年代初又在青海建立了一個復份庫，至1995年，已保存了30多萬份材料(陳叔平，1995年)；而中科院於1996年則在西雙版納熱帶植物園建立了一個小型的熱帶瀕危植物種質庫。

(1)種子庫的溫度控制

由於種子貯藏特性的不同，也由於經濟原因和貯存的對象不同，基因庫設計的溫度並不一致。

(2)種子保存的程序

種子庫種子的保存程序主要是採集(發芽試驗)、乾燥、封存、儲存(發芽試驗)、更新長遠利等，各個庫對於這些程序具有不同的要求。圖8和圖9是美國兩個種子庫折操作程序參考。

2. 種子貯存的一些原理

種子是一種最主要的種質材料。貯藏種子的目的在於延長種子壽命、保護活力、保持活力並保存植物固有種質(基因)，而延長種子種子壽命是最爲基本的目標。種子的壽命問題就是種子生命力控制問題，而種子的貯藏壽命與種子含水量及貯藏溫度密切相關。哈靈頓認爲，在一定的溫度範圍內(1～50℃)，溫度生增加5℃，或種子含水量每增加1%，則種子貯藏壽命減半(Harrington,1972年)。1973年，羅伯茨根據對種子貯藏特性的研究，把種子分爲正統型(orthodox)種子和頑拗型(recalcitrant)種子兩類(Roberts, 1973年，189年)。正統型種子的種子含水量能被幹燥至5%以下而不受傷害，並且其貯藏壽命隨種子含水量和貯藏溫度的降低而加長，大部分栽培作物的種子屬於此類型。多數野生植物尤其是熱帶植物種子，根據目前的研究，其種子含水量必須保持某一較高水平，通常不低於15%，否則將失去生命力。羅伯茨及其研究生艾力斯通過多年研究，幾經修改一，提出了一個種子貯藏壽命的計算方程式(Khan,1982年；Ellis,1988年;Robert,1989年):

式中：V-種子生命力，有概率表示，概率與百分率可以換算，因此生命力可用發芽百分率來代表；Ki-初始生命力，用概率表示，可用種子儲藏開始時的發芽率換算後替代；P-儲藏時間，以天爲單位；M-種子含水量（通常10%以下），以溼重爲基礎；t-儲藏溫度（攝氏）；Ke、Cw、CH 及CQ是不同的物種常數，對同一個物種來說，這四個數是固定不變的。

從式中可以看出，如果貯藏時間P值一定，種子生命力與種子含水量及貯藏溫度成反比關係。這些研究使人們開始進行種子的低溫乾燥保存，從而產生和發展了植物種質保存的基因 技術，也即是種子庫或種質庫(gene bank)技術。採集的種子經過良好的乾燥處理，降低種子含水量(通常至10%以下)，密封於鋁箔袋、鋁瓶或玻璃瓶中，在黑暗的低溫環境中(IBPGR 推薦長期庫爲-20℃，IBPGR，1985年)予以保存，每間隔一定時間進行生命力監測，這就是 基因庫保存種質材料的基本過程。

3. 兩種類型種子及貯存

根據種子的儲藏特性，一般把種子分爲兩種類型，即頑拗型種子和正統型種子，而熱帶地區的種子較多屬前者。實際上，至今對熱帶地區種子貯藏特性仍未有廣泛研究，缺乏系統資料，而一些典型的熱帶植物種子的確表現出頑拗型種子特性。因而通常認爲熱帶地區種子不能用常規基因庫技術加以保存。根據乾燥對種子生命力的影響，熱帶種子實際上也可以分爲兩類。

(1)頑拗型種子

這類種子不能進行乾燥處理，在日常溼、溫條件下乾燥也會很快喪失生命力(Barton,1961年)。其種子含水量通常不能降至12%以下，否則種子將死亡。這睦種子主要發生在熱帶的藤黃科(Guttiffarae)、龍腦香科(Dipterocarpaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、無患子科(Sap indaceae)、蕃荔枝科(Annonaceae.)、肉豆寇科(Myristicaceae)、桑科(Maoraceae)、胡頹子科(Elaeagnaceae)、山欖科(Sapotaceae)、馬錢科(Loganiaceae)等科中。它們多數在成 熟時具有較高的含水量(表12)

頑拗型種子不適宜於乾燥貯藏，通常低溫貯藏條件下也很快喪失生命力。這類種了需要在潮溼的環境，如溼沙中保存，以延長壽命。低溫環境對這類種子不利，尤其是零下低溫(Chako , 1971年)。

亞洲熱帶廣泛栽培的紅毛丹(Nephaleum lappaceum)種子以30%的含水量保存在21～28℃左右 的潮溼環境中能維護 6 個的壽命，但當種子含水量降至20%以下時則3天內失去生命力。

芒果種子在5～8℃低溫貯存20天后失去生命力，但在室溫溼沙貯存3個月仍有40.0%左右的萌發率。

(2)正統型種子

這類種子可以乾燥，並在低溫下可以採用基因庫技術進行種子保存，如禾本科植物的玉米、小麥和水稻，十字藥科的胡蘿蔔、甜菜，葫蘆科的黃瓜、南瓜，豆科的大豆、小扁豆、鷹嘴豆等。對分佈於西雙版納地區、作過種子貯藏實驗的124種植物種子進行了分析，說明通過低溫或乾燥處理，一年以後生命力仍保持50%以上的種類佔59.7%(陳瑛，1987年；陳耀武 ，1986年；管康林，1982年；肖耀，1982年；鍾志權，1983年)。而另外一些熱帶 種子出表 現出含水量減少，或貯藏溫度降低有延長壽命趨勢。古柯(Erythroxylum coca nat ense)種子採後在常溫下攤放，10天后僅40%萌發，20天后幾乎完全喪失生命力，但密閉存冰箱內，30天萌發率爲51.2%，50天后仍有2.6%的萌發率(陳瑛，1987年)。瓜慄(Pachira macr ocarpa)種子含水量降到14.7%於℃下2個月完全喪失生命力；當種子含水量降到3%則在保存半年後仍有50%萌發率(管康林，1982年)。對於桫欏(Alsophila spinulosa)孢子的貯存說明 了孢子含水量和貯藏的溫度條件是影響其生命力保存的重要因素。據測定新鮮成熟的杪欏孢子含水量約40%，在室溫條件下以塑料袋封存帶孢子的葉片，孢子僅7～8天；如從新鮮葉片上快速脫下孢五，並降低孢子含水量到28.7%，裝入磨口玻璃瓶在室溫下貯存，孢子壽命達33天；而在冷藏條件下孢子壽命達半年以上，如干冷藏則可達463天。此外貯存空間的溼度條件下對桫欏孢子的壽命影響也較大。貯存在30%的空氣溼度條件下一年後檢查，孢子生命保存率爲76.5%；60%的空氣溼度爲63.7%；70%的空氣溼度爲53.8%；80%的空氣溼度爲24% ；而900%的空氣溼度則全部失去生命力(程治英等，1991年)。

一些難保存的熱帶種子，其失活的原因還在於採取不適當的乾燥技術。種子經暴曬後對其貯藏壽命極爲不利。採後經太陽暴曬乾燥和於室內攤放陰乾的雲南蘿芙(Rauvolfia yunnanens es)種子，分別貯存254天后，前者萌發率僅爲7.3%，後者則保持66.0%(陳瑛，1987年)。瓦氏馬錢(Strychnos wallichiana)鮮種子發芽率86.7%，陰乾7天后失水44.8%(佔鮮重)，發芽率50%；但曬乾6小時失水35.2%，發芽率65%；曬20小時後，失水率48.9%，發芽率則已降至8 .3%(陳瑛，1987年)只要乾燥方法得當，即使是一些頑拗型種子，也是不會致死的(徐是雄，1987年)。可可(The obroma cocoa) 種子在45℃下乾燥即死亡，但如在20℃鼓風吹或用乾燥劑吸水，使其含水量由45%迅速降到33%～35%，則在33%～35%，則在17～30℃中貯藏7天后，發芽率達67%以上(Ho r,1984年)。白木香(Santalum album)種子一般採後一週內喪失發芽力，但如在常溫下加速乾燥含水量降至6%，其貯藏壽命可延長10倍(張志權，1992年)。坡壘(Hopea hainaensis)咱子在33%～38%含水量、15～20℃中貯存一年以上仍保持80%的發芽率(陳青度，1982年；宋學知，1983年)。因此，熱帶植物種子不宜高溫或日曬乾燥，應在15～20℃恆溫下平攤陰乾或用風扇、吸水等加速乾燥，這樣可以擴大基軒庫技在熱帶植物中的應用範圍，使種子保存途徑在熱帶上種 質資源保護中發揮更大的作用(殷壽華，1993年)

4. 野生親緣種在種子庫中保存情況

農業發展的歷史表明，栽培作物的野生親緣種在育種上具有巨大的經濟潛力，如引自土耳其的一個小麥野生親緣種爲小麥商業變種提供的抗病基因，僅在美國一地，每年價值500萬元 美元，一個埃塞俄一的大麥單株具有對大麥毀滅性的黃矮病毒病在抗性的基因，它保護了加 利福尼亞年值16000 萬美元大的麥免遭此病危害；有一個野生忽布使英國啤酒有一種摽煽的苦味,使得1981年給英國啤酒贏利1500萬美元(Hoyt,許定發等譯，1990年)。這樣，國際社會極其重視栽培作物野生親緣種的調查、收集上新建的各種種子庫除了收集、保存農作物的傳統和地方品種外，野生親緣種的收集、保存也是它們的一個重點。據Hoyt 報道(計定發等譯，1990年)，世界上的種子庫已對小麥、馬鈴薯和番茄等的野生親級種進了廣泛的收集、保存，而其他的種類也在IBPGR的推動下，正在擴大收集與保存(如表13)

我國是世界上一個重要栽培作物的起源和演化中心，具有多樣化的作物野生親緣 ，近年爲已開始收集與保存。據報道(陳叔平，1995年)，在國有種子庫中已收集、保存的野生親緣種有91種，超過10種的有水稻(13種)、花生(13種)、菸草(20種)和棉花(15種)等。

二、組織離體培養技術

離體主要是以組織培養(in vitro culture)的方法保存物種，這是近年發展起來的物種遷地保護方法之一。這種方法比起上述的其他方法可以減少。而這種方法主要的問題是遺傳基因 的不穩定性，尤其是當包含了愈傷組織時。當分生組織培養(meristem culture)在液態氮時 (-196℃)則有保存遺傳性的潛力(Franamkel,1981年)。

熱帶地區植物種質保存降可採取種子基因庫技術外，離體保存技術是一種重要的輔助手段。 對於具頑拗型種子的植物種類來說，它甚至是一種占主導地位的種質保存方法 。東南亞重要用材樹種經龍腦香科諸物，其種子保存甚爲困難，國際遺傳委員會(IBPGR)在英國皇家植 物園已開始了對它們的離體保存研究。皇家植物園邱園還利用微繁殖(micropropagation)對 蘭類(orchids)及蕨類(ferns)植物開展了離體保存實踐(殷壽華，1993年)。

1. 慢生長的種質保存

離體保存及其研究始於70年代(羅士偉，1987年)，主要是以組織培養的方示來貯藏種質。植物細胞和培養體在適宜條件下存在着一種典型的生長模式(Reed,1989年)。首先進入稱爲延滯期(lag period)的慢生長階段；隨後是快生長階段，上旨細胞以指數狀態增生；最後，培養體進入生長靜止期(stationary growth period)，細胞數量保持衡定。造成生長靜止原因 是培養基中某種或某些關鍵營養耗盡，如不更換培養基，培養體會逐漸死亡。從延滯期到生長靜止期的時間長度受多種因素的影響，依物種和培養體類型的不同一般爲至六週。但是，通過調節和改變與培養體生長有關的某些條件，則可能延長繼代培養所需時間。這就是一種稱爲慢生長系統(slow--growth system)的植物種質離體保存方法。

種質材料在離體保存時的生長速度可用多種方法控制，最常用的方法最降低溫度。多數植物的培養體最佳生長溫度爲20～25℃，當降至6～12℃時生長速度明顯下降。少數熱帶種類最 佳生長溫度爲30℃，一般在20℃時可降低生長速度。澳大利嚴國王公園與植物園(Kings Par k and Botantic Garden)將培養體保存在7～10℃，有持續弱照的環境中，繼代培養時間可比通常後6～12個月(Kinsley,1984 年)。對於若干種省藤(Calamus spp.)的種質離體保存，程冶英等採用減少培養基中碳原含量、降低培養基水份含量、低鹽(1/2～1/10的無機鹽含量)與政黨無機鹽濃度的培養替使用、採用液體培養基使培養材料在低氧下生長和發取單芽在 培養基上等措施，降低了省藤細胞生長速度而使繼代時間在6個月以上(程冶英,1996年)。

在培養基中加入生長延緩劑使培養體生長速度減慢也是一種常用的方法。它們或者以滲透劑 的形式如甘露聚糖醇，或者是天然激素如脫落酸。木薯尖組織培養體在20℃溫度下，用4%蔗糖與0.01mg/L的苯甲氨基嘌呤(BAP)或者2%蔗糖與0.05mg/LABP，均能使其生存率在15個月的 繼代培養間隔中達955。如果避免使培養基耗盡，也能長繼代培養所需的時間(Henshaw,1983 )。對於桫欏的配子體世代的保存採用加大孢子播種密度(4000個/cm2)、選用高鹽培養基或站加2，4-D1-4、糖濃度爲0～1%，附加細胞分裂素和生長素的比爲10：1，以及僅用MS培養 基的微量元素製作培養基等均可延續其生長速度，使保存材料9～16個月不繼代也不會死亡( 程冶英等，1991年)。

2. 超低溫的種質保存

離體保存術可以在不同地區廣泛使用，但所耗經費比種子保存多。慢生長系統在種質材料的轉移和保存過程中仍需要大量的人工操作，而且由同一組織培養出來的後代普遍存在着無性差異這咱差異隨培養時間的增長而增加。因此，慢生長系統只能作爲短期或中期貯藏種質的方法。目前正在深入研究的超低溫保存法，也許能作爲長期貯藏種質的離體保存方法之 一(Withers, 1986年)。這種方法是將組織體(包括種子等)保存在-19℃的液氮環境中，能 較長期的保持遺傳穩定性。這一技術包括以下6個步驟：

(1)前生長

對培養體短期的生長處理，使其提高耐液氮保存的能力。如對一種茄屬(Solanum sp.)植物的研究，證明必需在光照下經過2天的前生長處理，纔會在液氮保存後得以生存(Towill,1981年)。

(2)防凍

培養體放入防凍液中，使其細胞降低冰點，減少因形成冰晶可能造成的損傷。防凍劑可單獨或混合使用，混合使用時可以會減少防凍劑的毒害作用。分生組織或莖尖(根尖)培養體最佳 防凍劑是5%～15%的DMSO液。

(3)冷凍

降溫冷凍。降溫速度依不同種類有的不同。慢降溫一般爲1～2℃分鐘，慢速降溫可使本逐漸脫水，從而減少細胞間冰晶形成。但速度太慢會導致脫水過甚引起傷害，因而有時採取50～ 100℃/分鐘的速度快速降溫。

(4)超低溫保存

將冷凍材料保存到有效低溫環境中，以防止冰的遊移或解體。短期或中期保存常採取-80℃到-100℃溫度，長保存則採取-196℃的液氮或其蒸氣(-150℃)環境。

(5)解凍

一般認爲快速解凍更好。從液氮環境中取出封裝好的材料，與其容器一同放入 40℃的無菌中，直到解凍後纔回到室溫下，未封裝的材料放到20～30℃的液體培養基中解凍。

(6)生命力測定

如用TTC染色法等。中國農科院國家種質庫作了蕎麥花粉的液氮貯茂。採到的花粉在22～23℃溫度下脫水風乾30～90分鐘，使含水量降至10%以下，置於密封膠管中放液氮罐內保存。解凍時採取40℃環境 經2分鐘即可。經授粉試驗，結實良好，取得了較好的經驗。